La película cuenta la historia de uno de los increíbles rodajes que vinieron a filmar los americanos a nuestro país a partir de 1956, una vez terminado el bloqueo internacional a la dictadura. Macarena Granada (Penélope Cruz), la gran estrella «americana» de origen español, retorna a su tierra para encarnar a Isabel la Católica. Al enterarse Blas Fontiveros (Antonio Resines), que no había vuelto a España desde que se fuera a dirigir La niña de tus ojos 18 años atrás, decide regresar y encontrarse con algunos de sus viejos amigos. Su llegada desata una serie de acontecimientos que pondrán a prueba el rodaje de la superproducción.
Al reencuentro del reparto original de La niña de tus ojos, con Penélope Cruz, Antonio Resines, Jorge Sanz, Santiago Segura, Loles León, Rosa María Sardá, Neus Asensi y Jesús Bonilla, se suman Javier Cámara, Chino Darín, Ana Belén, los directores Juan Antonio Bayona y Arturo Ripstein y los actores internacionales Mandy Patinkin (Homeland), Clive Revill (Avanti!) y Cary Elwes (La princesa prometida).
Según Trueba:
«La Reina de España nace de mi deseo de hacer una comedia y de continuar con la historia de unos personajes que no me dejaban en paz, que querían seguir en mi cabeza. Pero no considero que sea una secuela o segunda parte, porque no cuenta la misma historia: Como hizo Dumas con los mosqueteros, tan solo he pretendido reunir 18 años después a unos personajes que me han perseguido todo este tiempo. Y de esta forma, hablar del oficio del Cine con toda la humildad del mundo y homenajear a su gente, sus técnicos y actores…»